大肠埃希菌O157的ISO方法解读！


大肠埃希菌O157作为食品致病菌，早就引起人类的注意。2001年，ISO发布了ISO 16654:2001食品和动物饲料微生物学大肠埃希菌O157检测的水平方法，对食品和饲料中的E.coli O157检测，给出了标准方法。
O157是E.coli的血清型。我国标准要求在牛肉制品和生食果蔬制品中不得检出。在ISO 16654:2001中，E.coli O157的检测分为四步：
1）增菌。采用含新生霉素的改良型TSB肉汤，41.5℃孵育6h，再紧接着孵育12-18h；
2）分离和富集。需要采用针对O157的抗体包被的免疫磁珠；
3）检出：采用CT-SMAC平板和另一款原理不同的选择性分离琼脂
4）验证：对CT-SMAC平板上的山梨醇阴性菌落和第二款选择性分离琼脂上的E.coli O157典型菌落，通过吲哚试验和E.coli O157抗血清的凝集试验进行验证。
增菌阶段，ISO推荐用Modified tryptone soya broth，即改良型TSB肉汤，对此，HIMEDIA生产有Soyabean Bile Broth Base（货号M1286）和新生霉素添加剂（货号FD290），配方和ISO推荐的改良型TSB肉汤完全一致，可以采用。
对于CT-SMAC琼脂，HIMEDIA也生产有相应培养基（货号M1340，加添加剂，货号为FD147），培养结果见下图。O157为无色菌落。但不排除假阳性，如假单胞菌在此培养基中也可产生无色菌落。此时可进行氧化酶试验，在5-10秒内观察结果。假单胞菌为阳性，而O157为阴性。
同时，ISO 16654:2001也指出，存在山梨醇阳性的E.coli O157不会被CT-SMAC平板检测到。因此推荐同时使用另外一款选择分离培养基。此时可考虑HIMEDIA的另外一款O157选择性琼脂（显色培养基），货号为MV1575A，品名为HiCrome EC O157:H7 Selective Agar Base,Modified，配合添加剂（货号FD187）一起使用。其检测效果见下图。E.coli O157:H7能旺盛生长，菌落呈深紫色，而普通E.coli呈蓝绿色。
培养基添加剂中的亚碲酸钾能抑制气单胞菌和普罗威登菌生长，新生霉素抑制革兰阳性菌，月桂基**钠抑制伴随的革兰阳性菌群。
在验证阶段，ISO也提示，发现存在吲哚阴性的突变菌。因此，也可以考虑用qPCR或多种生化鉴定的方式进行验证。
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